Javascript ist derzeit in Ihrem Browser deaktiviert.Mehrere Funktionen dieser Website funktionieren nicht, wenn Javascript deaktiviert ist.freier Zugang zu wissenschaftlicher und medizinischer ForschungVon der Einreichung bis zur ersten redaktionellen Entscheidung.Von der redaktionellen Abnahme bis zur Veröffentlichung.Der oben genannte Prozentsatz an Manuskripten wurde in den letzten 12 Monaten abgelehnt.Peer-reviewte wissenschaftliche und medizinische Open-Access-Zeitschriften.Dove Medical Press ist Mitglied des OAI.Massennachdrucke für die pharmazeutische Industrie.Wir bieten unseren Autoren echte Vorteile, einschließlich einer beschleunigten Bearbeitung von Papieren.Registrieren Sie Ihre spezifischen Daten und spezifischen Arzneimittel von Interesse und wir gleichen die von Ihnen bereitgestellten Informationen mit Artikeln aus unserer umfangreichen Datenbank ab und senden Ihnen umgehend PDF-Kopien per E-Mail zu.Zurück zu Zeitschriften » International Journal of Nanomedicine » Volume 14Die antitoxischen Wirkungen von Quercetin und Quercetin-konjugierten Eisenoxid-Nanopartikeln (QNPs) gegen H2O2-induzierte Toxizität in PC12-ZellenAutoren Yarjanli Z, Ghaedi K, Esmaeili A, Zarrabi A, Rahgozar SVeröffentlicht am 26. August 2019 Band 2019:14 Seiten 6813—6830DOI https://doi.org/10.2147/IJN.S212582Begutachtung durch einmaliges anonymes Peer-ReviewHerausgeber, der die Veröffentlichung genehmigt hat: Prof. Dr. Anderson Oliveira LoboZahra Yarjanli,1 Kamran Ghaedi,1 Abolghasem Esmaeili,1 Ali Zarrabi,2,3 Soheila Rahgozar1 1Department of Biology, Faculty of Sciences, University of Isfahan, Isfahan, Iran;2Fakultät für Biotechnologie, Fakultät für fortgeschrittene Wissenschaften und Technologien, Universität Isfahan, Isfahan, Iran;3Sabanci University Nanotechnology Research and Application Center (SUNUM), Istanbul, Türkei Korrespondenz: Kamran Ghaedi Department of Biology, Faculty of Sciences, University of Isfahan, Hezar Jerib Ave., Azadi Square, 81746 Isfahan, Iran Tel +98 313 793 2479 Fax + 98 313 793 2456 E-Mail [email protected] Hintergrund: Wir haben kürzlich gezeigt, dass Quercetin-konjugierte Eisenoxid-Nanopartikel (QNPs) die Bioverfügbarkeit von Quercetin (Qu) im Gehirn von Ratten förderten und das Lernen und Gedächtnis von diabetischen Ratten verbesserten.In dieser Studie charakterisierten wir die Modifikationen in den antitoxischen Wirkungen von Qu nach der Konjugation.Materialien und Methoden: Wir konjugierten Qu mit Dextran-beschichteten Eisenoxid-Nanopartikeln (DNPs) und charakterisierten DNPs und QNPs mit FTIR-, XRD-, DLS-, Fe-SEM- und EDX-Analysen.Die antiradikalischen Eigenschaften von Qu, DNPs und QNPs wurden durch 2, 2-Diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH)-Abfangaktivitätsassay verglichen.Katalase-ähnliche Aktivitäten von DNPs und QNPs wurden mit dem Katalase-Aktivitäts-Assay-Kit abgeschätzt, und die antitoxischen Wirkungen von Qu und QNPs wurden mit Spektrophotometrie, MTT-Assay, Durchflusszytometrie und Echtzeit-q-PCR bewertet.Ergebnisse: Qu hatte eine stärkere antiradikale Aktivität als DNPs und seine Aktivität nahm ab, nachdem es an DNPs konjugiert worden war.Die Katalase-ähnliche Aktivität von DNPs blieb nach der Konjugation intakt.DNPs hatten im Vergleich zu freiem Qu eine geringere Toxizität für die Lebensfähigkeit von PC12-Zellen, und die Konjugation von Qu mit DNPs schwächte seine Zytotoxizität ab.Darüber hinaus zeigten die MTT-Testergebnisse, dass eine 24-stündige Vorbehandlung mit Qu eine stärkere Schutzwirkung als QNPs gegen H2O2-induzierte Zytotoxizität hatte, während Qu und QNPs die gleichen Wirkungen bei einer 48- und 72-stündigen Inkubation hatten.Obwohl die antioxidative Gesamtkapazität von Qu nach der Konjugation abgeschwächt war, bestätigten die Ergebnisse der Durchflusszytometrie und der Echtzeit-q-PCR, dass eine 24-stündige Vorbehandlung mit den niedrigen Konzentrationen von Qu und QNPs ein ähnliches Antioxidans, entzündungshemmende und antiapoptotische Wirkung hatte Wirkungen gegen die Zytotoxizität von H2O2.Schlussfolgerung: Qu und QNPs zeigten ähnliche Schutzaktivitäten gegen H2O2-induzierte Toxizität in PC12-Zellen.Angesichts der Tatsache, dass QNPs magnetische Eigenschaften haben, können sie als geeignete Träger für die neuronale Forschung und Behandlung dienen.Schlüsselwörter: antitoxische Wirkung, Eisenoxid-Nanopartikel, Quercetin, PC12-ZellenQuercetin (Qu) (C15H10O7), 3, 3ʹ, 4ʹ, 5, 7-Pentahydroxyflavon,1 ist eine der polyphenolischen Verbindungen, die zur Flavonol-Unterklasse der Flavonoide gehören,2 die wegen ihres Antioxidans,3–5 entzündungshemmend untersucht wurde ,6–8 antiapoptotische,9 und krebshemmende10 Eigenschaften.Trotz der nützlichen Eigenschaften von Qu kann es aufgrund der geringen Bioverfügbarkeit, der geringen Löslichkeit in Wasser, der schnellen Ausscheidung aus dem Körper, des schnellen Stoffwechsels und des Abbaus durch Enzyme nicht als Medikament wirken.11 Daher muss Qu für die Anwendung als Medikament einer Behandlung unterzogen werden einige Manipulationen.Magnetische NPs, insbesondere Fe3O4, haben viel Aufmerksamkeit in therapeutischen Anwendungen wie MRT, Wirkstoffabgabe, Zellverfolgung, Hyperthermie, Gewebezüchtung, magnetischer Trennung und biologischer Trennung auf sich gezogen.12 Daher entschieden wir uns, diese NPs als Trägerkandidaten für zu verwenden Liefern Qu.Kumar und Kollegen (2014) konjugierten Qu mit Dextran-beschichteten Eisenoxid-Nanopartikeln (DNPs), um die krebshemmenden Eigenschaften von Qu auf Brustkrebszellen (MCF-7) zu verbessern.10 Unsere Gruppe stellte auch Qu-konjugierte DNPs (QNPs) her ( mit einigen Manipulationen) und in unseren früheren Studien interessante Ergebnisse erzielt.13,14PC12-Zellen, die aus Ratten-Nebennieren-Phäochromozytom stammen, zeigten die Eigenschaften sympathischer Neuronen, wenn sie mit Nervenwachstumsfaktor (NGF) behandelt wurden.Diese Zellen, die in der Lage sind, die Neurotransmitter Dopamin und Noradrenalin zu produzieren,15 wurden in mehreren Studien als geeignetes Zellmodell verwendet.3,16,17 Angesichts der Tatsache, dass unsere frühere Studie die schützende Wirkung von QNPs auf Lernen und Gedächtnis bei Diabetes-Modellratten gezeigt hat, 14 scheint es notwendig, die Schutzwirkung von QNPs in einem Zellmodell zu untersuchen.Wasserstoffperoxid (H2O2) ist eines der natürlichen Produkte des Sauerstoffstoffwechsels in Zellen, das mit zellulären Makromolekülen reagieren und eine Situation schaffen kann, die als oxidativer Stress bezeichnet wird und mit einer Vielzahl von Erkrankungen zusammenhängt, darunter Alterung, Schlaganfall, Arteriosklerose, Krebs, Diabetes, Herzinsuffizienz und Parkinson-Krankheit.18 Daher betrachtete unsere Gruppe H2O2 als Oxidationsmittel, um Toxizität in PC12-Zellen zu induzieren, und untersuchte die antitoxischen Eigenschaften von Qu gegenüber H2O2 vor und nach der Konjugation an DNPs.Alle für die QNP-Synthese erforderlichen chemischen Materialien, einschließlich Qu (≥95 % Reinheit, Q4951, Molekulargewicht: 302,2 g.mol−1), Dextran (Molekulargewicht: 10.000 Da), Eisen(III)-chlorid (FeCl3) und Eisen (II )-Chlorid (FeCl2) wurden von Sigma-Aldrich Co. (St. Louis, MO, USA) oder EMD Millipore Co. (Billerica, MA, USA) bezogen.Die für die Zellkultur erforderlichen Materialien einschließlich phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS), RPMI 1640 und andere wurden von Bioidea Co. (Teheran, Iran) bezogen.DNPs wurden mithilfe der chemischen Kopräzipitationsmethode hergestellt (Abbildung 1), wie in unserer vorherigen Studie berichtet.13 1,135 g FeCl2, 0,695 g wasserfreies FeCl3 und 0,45 g Dextran wurden mit einem Magnetrührer in DI-Wasser gelöst.Dann wurde der pH-Wert der Lösung durch Zugabe von Ammoniaklösung auf 9 erhöht.Die Temperatur der Lösung wurde unter Rühren 2 h bei 90°C gehalten.Dann wurde die Lösung auf Raumtemperatur abgekühlt.Unter Verwendung eines starken Magnetfelds wurden DNPs ausgefällt und gesammelt.Nach dem Waschen mit DI-Wasser und Alkohol wurden die DNPs in einem Gefriertrockner (Zirbus, Vaco5, Deutschland) getrocknet und zur Charakterisierung verwendet.Abbildung 1 Die Schritte der QNP-Synthese.(A) Das schematische Bild der Synthese von DNPs und QNPs;DNPs wurden unter Verwendung eines chemischen Kopräzipitationsverfahrens und in Gegenwart von Dextran hergestellt;und Qu wurde mit Hilfe von EDC und NHS als Linker an DNPs konjugiert.(B) Der chemische Weg der DNPs- und QNPs-Synthese.Abbildung 1 Die Schritte der QNP-Synthese.(A) Das schematische Bild der Synthese von DNPs und QNPs;DNPs wurden unter Verwendung eines chemischen Kopräzipitationsverfahrens und in Gegenwart von Dextran hergestellt;und Qu wurde mit Hilfe von EDC und NHS als Linker an DNPs konjugiert.(B) Der chemische Weg der DNPs- und QNPs-Synthese.QNPs wurden gemäß unserer vorherigen Studie synthetisiert.13 Kurz gesagt, 10 mg DNPs wurden in Dimethylsulfoxid (DMSO) und einer erforderlichen Menge N-Hydroxysuccinimid (NHS) und 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimid (EDC) gelöst ) wurden dieser Mischung zugesetzt.Die Mischung wurde 30 Minuten lang einer Ultraschallbehandlung ausgesetzt und dann wurden 10 mg Qu – gelöst in DMSO – zu dieser Mischung gegeben.Die Mischung wurde für 24 h in einem Schüttelinkubator bei 20°C gehalten.Unter Verwendung eines starken Magneten wurden die resultierenden QNPs gesammelt und dann in einem Gefriertrockner getrocknet und für weitere Studien verwendet.Um in erster Linie die Löslichkeit zwischen Qu und QNPs zu vergleichen, wurde 1 mg jeder Probe in 2 ml PBS in einem Reagenzglas gelöst.Nach 5-minütiger Beobachtung wurden die Ergebnisse als Fotos berichtet.2 mg QNPs wurden in 2 ml PBS in einem Reagenzglas gelöst und dann unter Verwendung eines Magneten die magnetischen Eigenschaften von QNPs vorläufig untersucht.Um die chemischen Wechselwirkungen zwischen Qu und DNPs zu bewerten, wurde eine Fourier-Transformations-Infrarot(FTIR)-Spektrometrie von freiem Qu, DNPs und QNPs unter Verwendung eines FT-IR-Spektrometers (JASCO FT/IR-6300, Japan) im Bereich von 350 durchgeführt –7800 cm−1 nach KBr-Pellet-Methode.Um die kristalline Struktur von DNPs und QNPs zu untersuchen, wurden die Röntgenbeugungsmuster (XRD) mit einem Röntgendiffraktometer (BRUKER, D8 ADVANCE, Deutschland) bei Raumtemperatur aufgenommen.Um die Größe und Form von QNPs zu untersuchen, wurden Untersuchungen mit dynamischer Lichtstreuung (DLS) und Feldemissions-Rasterelektronenmikroskopie (FE-SEM) mit dem VASCO FlexTM Particle Size Analyzer NanoQ V2.5.4.0 (USA) DLS und Hitachi implementiert S–4700 FE–SEM (Japan).Das FE-SEM war mit einem energiedispersiven Röntgenanalyse(EDX)-Detektor zur Bestätigung der Identität von Eisenoxid-Nanopartikeln (IONPs) ausgestattet.Zunächst wurde eine Eichkurve aus dem Absorptionswert von Qu in DMSO erstellt.Unter Verwendung der Absorptionsgleichung von Qu in DMSO (1) wurde die Konzentration von restlichem (unbeladenem) Qu berechnet und dann wurde der Prozentsatz der Qu-Beladung auf QNPs unter Verwendung von Gleichung (2) geschätzt.(1)*(Y: die Absorption von Qu in DMSO und X: Qu-Konzentration) (2)Um die Qu-Freisetzung aus QNPs zu beurteilen, wurde eine Kalibrierungskurve aus dem Absorptionswert von Qu in PBS gezogen und die Absorptionsgleichung von Qu in PBS wurde mit Excel berechnet (3).Dann wurden 1 mg QNPs in 1 ml phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS, pH: 7,4) suspendiert und in Zellulose-Dialysebeutel (mit einer Molekulargewichtsgrenze von 12.000 Da) gegossen.Dann wurde der Dialysebeutel in 50 ml PBS (pH: 7,4 oder pH: 4,8) gegeben.Die Dialyse wurde unter konstantem Schütteln bei 200 U/min bei 37 °C ± 0,5 °C durchgeführt.1 ml jeder Probe wurde entnommen und ihre Absorption wurde alle 24 h bei einer Wellenlänge von 260 nm mit einem Spektrophotometer (SHIMADZU, UV-1280, Japan) gemessen.Dann wurde die Probe in ihre Schale zurückgebracht.Der Prozentsatz der Qu-Freisetzung wurde unter Verwendung von Gleichung (4) geschätzt.(3)*(Y: die Absorption von Qu in PBS und X: Qu-Konzentration) (4)Um die Katalase-ähnliche Aktivität von DNPs und QNPs zu bestimmen, wurde 1 mg DNPs oder QNPs zu 3 ml H2O2 (10 M) gegeben.Die Produktion von O2-Gas, beobachtbar als Knollen im Löslichen, gilt als vorläufiges Zeichen für die Katalase-ähnliche Aktivität der NPs.Um die Katalase-ähnliche Aktivität zu verifizieren, wurde ein Katalase-Aktivitäts(CAT)-Assay-Kit (ZellBio GmbH, Deutschland) verwendet.Die 100- und 1000-µg.ml-1-Dosen von DNPs und QNPs wurden hergestellt;die Katalase-ähnlichen Aktivitäten der Proben wurden gemäß der Kit-Anleitung mit einigen Änderungen berechnet;und die Ergebnisse als Diagramm angezeigt.(5)Für die quantitative Untersuchung der gesamten antioxidativen Kapazität (TAC) wurden die 100- und 1000-µg-ml-1-Dosen von QNPs und sein Äquivalent von Qu (42 und 420 µg-ml-1) hergestellt;die TACs der Proben wurden gemäß den Anweisungen des TAC-Testkits (ZellBio GmbH, Deutschland) mit einigen Änderungen berechnet;und die Ergebnisse als Diagramm dargestellt.Um die Radikalfängeraktivität von Qu, DNPs und QNPs zu vergleichen, wurde das 2,2-Diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH)-Radikal (Sigma-Aldrich, Darmstadt, Deutschland) gemäß dem Kit-Protokoll mit einigen Manipulationen verwendet.In einem typischen Verfahren wurden 3 mg Qu, DNPs und QNPs abgewogen und dann 10, 100 und 1000 µg.mL−1 Konzentrationen von Qu, DNPs und QNPs in Methanol hergestellt.Die Lösungen mit einem Verhältnis von 1 ml DPPH (0,5 mM in Methanol) zu 3 ml Methanol (als Kontrolle) oder Probe wurden hergestellt.Die Absorption der Lösung wurde bei 517 nm Wellenlänge mit einem Spektrophotometer (SHIMADZU, UV-1280, Japan) nach 0,5, 3, 6, 9 und 12 h aufgenommen.Der Prozentsatz der Hemmung wurde für jede Probe unter Verwendung von Gleichung (6) berechnet.(6)PC12-Zellen wurden vom Pasteur Institute of Iran (Teheran, Iran) gekauft und in RPMI 1640-Medium kultiviert, das 10 % fötales Rinderserum (FBS), 1 % L-Glutamin und 1 % Penicillin/Streptomycin (Pen/Strep) enthielt, und inkubiert bei 95 % Luftfeuchtigkeit und 5 % CO2 bei 37‌°C.Zur Durchführung von zellulären Assays in dieser Studie wurde RPMI-Medium verwendet, das 5 % FBS und 1 % (Pen/Strep) enthielt.Um die Zelllebensfähigkeit zu bestimmen, wurden PC12-Zellen auf Platten mit 96 Vertiefungen in einer Dichte von 2 × 10 4 Zellen ausgesät. 100 &mgr;l –1 Medium in einer Vertiefung, und die Zelllebensfähigkeit wurde unter Verwendung von 3-(4,5-Dimethylthiazol-2) bestimmt -yl)-2,5-diphenyltetrazoliumbromid (MTT)-Reduktionsassay.24 Stunden nach der Aussaat wurden die Zellen mit den verschiedenen Konzentrationen von Qu (in Medium mit 0,01 % DMSO), DNPs, QNPs oder H2O2 für 24, 48 oder 72 h inkubiert.Anschließend wurden die Zellen mit PBS gewaschen und mit 0,25 mg MTT.mL−1 (Endkonzentration) für 2–4 h bei 37 °C inkubiert.Um die resultierenden Formazan-Kristalle aufzulösen, wurde das Medium entfernt und 100 &mgr;l DMSO wurden zu jeder Vertiefung gegeben.Die Extinktion der Vertiefungen wurde unter Verwendung eines ELISA-Mikroplattenlesegeräts (Awareness STAT FAX 2100, USA) bestimmt.Die Zelllebensfähigkeitsprozentsätze wurden unter Verwendung von Gleichung (7) berechnet.(7)Um den Eintritt von QNPs in PC12-Zellen abzuschätzen, wurden 5 × 10 5 Zellen/15.000 &mgr;l Medium (RPMI, enthaltend 5 % FBS und 1 % Pen/Strep) in jede Vertiefung einer Platte mit 6 Vertiefungen ausgesät.Nach 24 h wurden die Zellen mit 0, 5, 10, 25, 50 und 100 µg.mL-1 Konzentrationen von QNPs für 24 h inkubiert.Nach dem Waschen mit PBS wurden ungewaschene QNPs mit Hilfe eines externen Magnetfelds entfernt.Dann wurden die Zellen trypsinisiert und gezählt.Eine gleiche Anzahl der Zellen wurde aus jeder QNP-Konzentration entnommen und über Nacht 1 ml 37%iger HCl ausgesetzt.Die resultierenden Mischungen wurden filtriert und mit 3 ml PBS verdünnt.Schließlich wurde die intrazelluläre Eisenkonzentration mit einem induktiv gekoppelten Plasma-optischen Emissionsspektrometer (ICP-OES) (Analytic Jena, PQ 9000, Deutschland) gemessen und als Diagramm dargestellt.Zusätzlich zu ICP-OES wurde eine Preußisch-Blau-Färbung durchgeführt, um den Eintritt von QNPs in die Zellen zu bestätigen.Nach 24-stündiger Inkubation der Zellen mit unterschiedlichen QNP-Konzentrationen, einschließlich 0, 25, 50 und 100 µg.mL-1, wurden die Zellen mit 4 % Paraformaldehyd fixiert und mit 4 % Kaliumferrocyanid-Trihydrat/4 % Salzsäure-Mischung gefärbt ( 1:1, v/v) für 20 min bei Raumtemperatur19 und anschließend mit neutralroter Lösung (0,5 %, w/v) für 5 min gegengefärbt.Um die antitoxischen Wirkungen von Qu und QNPs gegenüber der Toxizität von H2O2 in PC12-Zellen primär zu untersuchen, wurde ein MTT-Assay durchgeführt.Im Folgenden wurden zur Bestätigung der Schutzwirkung von Qu und QNPs und zur Bestimmung des am Schutz beteiligten Mechanismus Durchflusszytometrie und Echtzeit-q-PCR-Techniken durchgeführt.Verschiedene QNP-Dosen, einschließlich 0, 1, 2,5, 5, 10, 25, 50 und 100 µg.mL-1, wurden ausgewählt und dann wurden angesichts des Prozentsatzes der Arzneimittelbeladung äquivalente Konzentrationen von konjugiertem Qu berechnet: 0, 0,42, 1,05 , 2,1, 4,2, 10,5, 21 bzw. 42 µg.mL-1 (Gleichung 8).Die Zellen wurden auf 96-Well-Platten ausgesät, mit den vorbereiteten Dosen von QNPs und Qu (in RPMI mit 5 % FBS und 0,01 % DMSO) für 24, 48 und 72 h vorbehandelt und nach dem Waschen mit PBS mit 1,5 mM H2O2 behandelt für 2 Std.Schließlich wurde der Prozentsatz der Lebensfähigkeit von PC12-Zellen wie zuvor erklärt bestimmt (Gleichung 7).(8)Nach Vorbehandlung von PC12-Zellen mit Qu oder QNPs (in 0,01 % DMSO enthaltendem Medium), Waschen mit PBS und Behandeln mit H2O2 wurden die Zellen mit PBS gewaschen, trypsinisiert und zentrifugiert.Dann wurden die Zellen 20 µM 2',7'-Dichlorfluoresceindiacetat (DCFDA, Sigma, USA) in PBS, zellulärer ROS-Nachweis-Assay-Kit, für 45 min bei 37 °C ausgesetzt und die Fluoreszenz wurde auf einem Durchflusszytometer gemessen ( BD FACSCalibur, Deutschland) mit einer Anregungswellenlänge von 485 nm und einer Emissionswellenlänge von 530 nm.In dieser Studie wurde Zytotoxizität als eine Sammlung von Prozessen betrachtet, einschließlich oxidativem Stress, Entzündung und Apoptose.Wie oben erwähnt, wurde oxidativer Stress mit dem DCFDA ROS-Assay-Kit bewertet.Dann wurden die Expressionsniveaus von Genen einschließlich induzierbarer Stickoxidsynthase (iNOS) und Tumornekrosefaktor-alpha (TNF-α) als Indikatorgene für Entzündungen und Bcl-2-assoziiertes X (Bax) als Regulatorgen für Apoptose untersucht Echtzeit-q-PCR.Wie zuvor erläutert, wurden die PC12-Zellen behandelt und gewaschen.Im Folgenden wurde zur Extraktion von Gesamt-RNA aus den Zellen Trizol-Reagenz (Invitrogen, USA) nach Herstellerangaben aufgetragen.Überschüssige DNA wurde entfernt, indem die Gesamt-RNA mit 1 U RNAase-freier DNase (Thermo Fisher Scientific Inc, USA) behandelt wurde, und dann wurden cDNAs aus DNase-freien RNAs unter Verwendung des PrimeScript TM RT-Reagenzienkits (Takara, Japan) gemäß dem synthetisiert Kit-Anleitung.Die Vorwärts- (F) und Rückwärts- (R) Primer für die spezifische Amplifikation der Gene, die unter Verwendung der Allele-ID-Primer-Design-Software Version 7.5 (Premier Biosoft, USA) entworfen wurden.Die Primerpaare für Gapdh (als Haushaltsgen) waren F: 5' TGCCGCCTGGAGAAACC 3' und R: 5' TGAAGTCGCAGGAGACAACC 3';für iNOS waren F: 5' AAGAGACGCACAGGCAGAG 3' und R: 5' CAGGCACACGCAATGATGG 3';für TNF-α waren F: 5' GTGTTCATCCGTTCCTAC 3' und R: 5' CCACAATTCCCTTTCTAAGT 3';und für Bax waren F: 5' TTTGCTACAGGGTTTCATC 3' und R: 5' ATGTTGTTGTCCAGTTCAT 3' (Macrogen, Südkorea).Die Expressionsniveaus von Genen wurden unter Verwendung von SYBR green (Ampliqon, Dänemark) verglichen;überwacht auf einem Bio-Rad-Nachweissystem (USA);und basierend auf dem 2-ΔΔCT-Verfahren berechnet.Die Daten wurden in Excel sortiert und mit der Software Graph Pad Prism 6 analysiert.Alle Daten wurden als Mittelwert ± SEM von Ergebnissen angegeben, die aus mindestens unabhängigen dreifachen Experimenten erhalten wurden.Die Einweg- oder Zweiweg-ANOVA, gefolgt von einem Post-hoc-Tukey-, Dunnett- oder Sidak-Mehrfachvergleichstest, wurden verwendet, um die Differenz als Mehrfachvergleichstests abzuschätzen.p-Wert < 0,05 wurde als signifikant angesehen.Die Beobachtung der Ablagerung von Qu und QNPs, sobald sie in PBS gelöst wurden und drei Minuten nach der Auflösung, zeigte, dass die Konjugation von Qu an DNPs die Löslichkeit von Qu nicht erhöhen konnte (Abbildung S1A und B).Die Absorption von QNPs zum Magneten zeigte, dass QNPs magnetische Eigenschaften hatten (Abbildung 2C).Das Erscheinen von Schwingungsspitzen im Bereich von 3300, 2900 und 1100 cm-1, die OH-, CH- bzw. COC-Bindungen zugeschrieben werden, in den FTIR-Ergebnissen von DNPs (Abbildung 2A) deutete auf die Polymerisation von Dextran auf der Oberfläche von IONPs hin.Erhöhte OH-, CH- und COC-Peaks und das Vorhandensein eines Vibrationspeaks im Bereich von 1640 cm-1, bezogen auf die C=C-Gruppe in der Qu-Struktur, in den FTIR-Ergebnissen von QNPs (Abbildung 2A), bestätigten die Konjugation von Qu an DNPs.Der höhere OH-Peak in den FTIR-Ergebnissen von QNPs im Vergleich zu den DNPs-Ergebnissen deutete auf eine Erhöhung der Löslichkeit von QNPs hin.20Abbildung 2 Physikochemische Charakterisierung von DNPs und QNPs.(A) Die Ergebnisse von FTIR bestätigten, dass die Polymerisation von Dextran und die Konjugation von Qu an die Oberfläche von IONPs korrekt durchgeführt wurde.(B) Das XRD-Bild zeigte, dass sich DNPs und QNPs in reiner Kristallphase befanden und die Fe3O4-Identität bestätigten.(C) Die magnetischen Eigenschaften von QNPs (roter Pfeil zeigt QNPs Aggregat).Die DLS-Ergebnisse (D) und die SEM-Bilder (E) von QNPs bestätigten, dass die Größe der NPs im Nanometerbereich lag.(F) Die EDX-Spektroskopie bestätigte die Identität der IONPs.Abbildung 2 Physikochemische Charakterisierung von DNPs und QNPs.(A) Die Ergebnisse von FTIR bestätigten, dass die Polymerisation von Dextran und die Konjugation von Qu an die Oberfläche von IONPs korrekt durchgeführt wurde.(B) Das XRD-Bild zeigte, dass sich DNPs und QNPs in reiner Kristallphase befanden und die Fe3O4-Identität bestätigten.(C) Die magnetischen Eigenschaften von QNPs (roter Pfeil zeigt QNPs Aggregat).Die DLS-Ergebnisse (D) und die SEM-Bilder (E) von QNPs bestätigten, dass die Größe der NPs im Nanometerbereich lag.(F) Die EDX-Spektroskopie bestätigte die Identität der IONPs.Um die kristalline Struktur von DNPs und QNPs zu untersuchen, wurde eine XRD-Analyse durchgeführt.Die Beobachtung der Beugungspeaks einschließlich 220, 311, 400, 422, 511 und 440° (Abbildung 2B), bezogen auf Fe3O4, bestätigte die kristallinen Strukturen von DNPs und QNPs;und das Fehlen zusätzlicher Peaks in den XRD-Bildern bestätigte die Reinheit von DNPs und QNPs.Die Größe der QNPs wurde durch zwei Techniken bestimmt, darunter DLS und SEM.Die DLS-Ergebnisse (Abbildung 2D) schätzten, dass die mittlere Größe der QNPs etwa 72,9 nm betrug.Zusammen mit den DLS-Ergebnissen wurden QNPs in den SEM-Bildern (Abbildung 2E) kleiner als 100 nm beobachtet.Darüber hinaus wurde die Identität der IONPs durch zwei bestimmte Spitzen von Eisen und Sauerstoff in der EDX-Spektroskopie bestätigt (Abbildung 2F).Angesichts der obigen Inhalte wurden DNPs und QNPs in einem perfekten Verfahren hergestellt und Beschichtungs- und Konjugationsverfahren wurden korrekt durchgeführt.Die Löslichkeit von QNPs war jedoch geringer als die von Qu, die Identität, Nanogröße, Reinheit und magnetischen Eigenschaften von QNPs wurden bestätigt.Die Arzneistoffbeladungsmenge wurde mit etwa 42 % gemessen (Gleichung 2).Der Arzneistofffreisetzungsassay wurde zehn Tage lang durchgeführt und seine Daten (Fig. 3) zeigten am ersten Tag keinen merklichen Unterschied zwischen neutralen (pH: 7,4) und sauren (pH: 4,8) Medien.Die kumulative Freisetzung am dritten Tag betrug 24,7 ± 2,9 % bei einem pH-Wert von 7,4, und eine Verringerung des pH-Werts bis auf 4,8 erhöhte den Wert der kumulativen Freisetzung auf 58,3 ± 4,3 %.Die maximale Freisetzung bei neutralem pH erfolgte am vierten Tag, was 20,4 % betrug, während die maximale Freisetzung bei saurem pH am zweiten Tag beobachtet wurde, was ungefähr 25,7 % entsprach.Nach einer Woche erreichte die kumulative Freisetzung in neutralem Medium (pH: 7,4) 72,6 ± 1,4 % und hörte auf, während die kumulative Freisetzung in saurem Medium (pH: 4,8) nach fünf Tagen 84,6 ± 2,9 % erreichte und dann aufhörte.Insgesamt verursachte die Verringerung des pH-Werts eine signifikante Erhöhung der Freisetzungsrate und -geschwindigkeit.Abbildung 3 Wirkstofffreisetzung aus QNPs.(A) Schematisches Bild der Dialyse;(B) die Standardkurve der Qu-Absorption in PBS;(C) Wirkstofffreisetzungsdiagramm zeigt, dass es während der ersten 24 h keinen signifikanten Unterschied zwischen zwei pH-Werten gibt, während der Unterschied an den nächsten Tagen zunahm (n = 3, Mittelwert ± SEM).Abbildung 3 Wirkstofffreisetzung aus QNPs.(A) Schematisches Bild der Dialyse;(B) die Standardkurve der Qu-Absorption in PBS;(C) Wirkstofffreisetzungsdiagramm zeigt, dass es während der ersten 24 h keinen signifikanten Unterschied zwischen zwei pH-Werten gibt, während der Unterschied an den nächsten Tagen zunahm (n = 3, Mittelwert ± SEM).Magnetit-NPs haben eine Katalase-ähnliche Aktivität und sind in der Lage, H2O2 zu H2O und O2 zu zersetzen (Gleichung 5).21 Die Beobachtung von Gaskugeln in beiden Lösungen, die DNPs und QNPs enthielten, zeigte in erster Linie, dass sie in der Lage waren, H2O2 zu H2O und O2 zu katalysieren (Abbildung 4A). ).Darüber hinaus zeigten die Ergebnisse des CAT-Assays, dass sowohl 100 als auch 1000 µg.mL-1 Dosen von DNPs und QNPs Katalase-ähnliche Aktivitäten aufwiesen.Wie Abbildung 4B zeigt, gibt es signifikante Unterschiede zwischen 100 und 1000 µg.mL-1 Dosen von DNPs (p<0,0001) und QNPs (p<0,001), während die Katalase-ähnlichen Aktivitäten von DNPs und QNPs keinen signifikanten Unterschied aufweisen.Somit hatten sowohl DNPs als auch QNPs dosisabhängige Katalase-ähnliche Aktivitäten.Abbildung 4 Katalase-ähnliche Aktivität von DNPs und QNPs.(A) Die Wechselwirkung von DNPs und QNPs mit H2O2;die Beobachtung von O2-Birnen bestätigt die Katalase-ähnliche Aktivität.(B) Das Diagramm der Katalase-ähnlichen Aktivitäten von DNPs und QNPs;beide NPs haben dosisabhängige Katalase-ähnliche Aktivitäten.(C) das Diagramm der gesamten antioxidativen Kapazität (TAC) von Qu und QNPs;Qu hatte eine dosisabhängige Kapazität und die Konjugation von Qu an DNPs führte zu einer merklichen Verringerung seiner antioxidativen Kapazität.n = 3, Mittelwert ± SEM, die Differenz von ab ist p < 0,0001 und a'-b' ist p < 0,001.****p<0,0001.Abbildung 4 Katalase-ähnliche Aktivität von DNPs und QNPs.(A) Die Wechselwirkung von DNPs und QNPs mit H2O2;die Beobachtung von O2-Birnen bestätigt die Katalase-ähnliche Aktivität.(B) Das Diagramm der Katalase-ähnlichen Aktivitäten von DNPs und QNPs;beide NPs haben dosisabhängige Katalase-ähnliche Aktivitäten.(C) das Diagramm der gesamten antioxidativen Kapazität (TAC) von Qu und QNPs;Qu hatte eine dosisabhängige Kapazität und die Konjugation von Qu an DNPs führte zu einer merklichen Verringerung seiner antioxidativen Kapazität.n = 3, Mittelwert ± SEM, die Differenz von ab ist p < 0,0001 und a'-b' ist p < 0,001.****p<0,0001.Um eine Veränderung der antioxidativen Wirkung von Qu nach der Konjugation an DNPs abzuschätzen, wurde ein Assay der gesamten antioxidativen Kapazität (TAC) durchgeführt.Wie in Abbildung 4C gezeigt, gibt es einen signifikanten Unterschied (p <0,0001) zwischen den TACs von Qu und QNPs bei Konzentrationen von 42 (100 für QNPs) und 420 (1000 für QNPs) µg.mL-1.Ein bemerkenswerter Unterschied wurde bei den TACs-Werten zwischen 42 und 420 µg.mL-1 Dosen von Qu oder QNPs nicht beobachtet.Daher verringerte die Konjugation von Qu an DNPs seine antioxidative Kapazität merklich.Die Aktivität zum Abfangen freier Radikale von Qu, DNPs und QNPs wurde unter Verwendung des DPPH-Abfangaktivitätsassays geschätzt.Verschiedene Konzentrationen von Q, DNPs und QNPs (10, 100 und 1000 µg.mL-1) wurden auf die Fähigkeit zur Hemmung von DPPH-Radikalen verglichen.Die Daten zeigten, dass die radikalfangende Aktivität von Qu dosisabhängig war (Abbildung 5A) und mit zunehmender Konzentration gefördert wurde, während die Expositionsdauer keinen Einfluss auf seine Aktivität hatte.Die Hemmfähigkeiten betrugen nach 12 h 70 ± 3 %, 78 ± 4 % und 85 ± 3 % für Konzentrationen von 10, 100 bzw. 1000 µg.mL-1.Abbildung 5 DPPH-Abfangwirkungen von Qu, DNPs und QNPs.(A) Das Diagramm zeigt, dass Qu im Vergleich zu QNPs und DNPs die meiste Aktivität zum Abfangen freier Radikale hatte;und seine Aktivität nahm mit zunehmender Konzentration zu, während seine Aktivität nicht von der Zeit abhing.(B) Das Diagramm der DNPs-Aktivität zeigte die niedrigsten Radikalfänger-Aktivitäten.Mit Ausnahme der Dosis von 10 µg.mL-1, die keine Wirkung hatte, zeigten DNPs eine Verbesserung ihrer Aktivitäten zusammen mit zunehmender Konzentration und Zeit.(C) Das Diagramm zeigte, dass QNPs dosis- und zeitabhängige Wirkungen zum Abfangen freier Radikale hatten (n = 3, Mittelwert ± SEM).*p<0,05, **p<0,01, ***p<0.001 und #p<0.0001.Abbildung 6 Die Toxizität von Qu, DNPs und QNPs auf PC12-Zellen.(A) Die MTT-Testergebnisse von Qu;Qu hat dosis- und zeitabhängige Toxizität auf die PC12-Zellen (ab, bc, cd, de, a'-b', b'-c', c'-d', d'-e', a''- h'', b''-c'', c''-d'', d''-e'' und e''-f'' haben signifikante Unterschiede zu *, ****, *** , *, **, ***, *, **, ***, ****, **** bzw. *).(B) die MTT-Assay-Daten von DNPs;DNPs haben eine geringe Toxizität für die Zellen (ab, a'-b', a''-b'' und b''-c'' weisen signifikante Unterschiede zu * auf).(C) die MTT-Assay-Ergebnisse von QNPs;QNPs hatten eine dosis- und zeitabhängige Zytotoxizität (ab, a'-b', a''-b'', b''-c'', c''-d'' und d''-e'' haben signifikante Unterschiede mit * und b'-c' haben signifikante Unterschiede mit **).*p<0,05, **p<0,01, ***p<0,001 bzw. ****p<0,0001.n = 6, Mittelwert ± SEM.Abbildung 7 Eingang der QNPs in die PC12-Zellen.(A) Schematisches Bild des ICP-Assays und Preußisch-Blau-Färbung.(B) das Arzneimittelfreisetzungsdiagramm;Die intrazelluläre Eisenkonzentration in PC12-Zellen war mit zunehmender QNP-Dosis erhöht (n = 3, Mittelwert ± SEM).*p<0,05 bzw. **p<0,01).(CF) Preußisch-Blau-Färbebilder;PC12-Zellen wurden mit QNP-Konzentrationen von 0 (C), 25 (D), 50 (E) und 100 µg.mL-1 (F) inkubiert.Die blau gefärbten Punkte, die an der Umgebung beobachtet werden und in die Zellen eindringen, bestätigen den Eintritt von QNPs in die Zellen.Pfeile zeigen QNPs an.Abbildung 8 Die antitoxischen Wirkungen von Qu und QNPs gegenüber H2O2 auf die Lebensfähigkeit von PC12-Zellen.(A) Die Wirkung einer 24-stündigen Vorinkubation mit QNPs oder Qu vor der H2O2-Behandlung auf die Lebensfähigkeit von PC12-Zellen;die niedrigen Dosen von QNPs oder Qu verbesserten die Lebensfähigkeit der Zellen signifikant.(B) Die Wirkung von 48 h Vorinkubation mit QNPs oder Qu;die niedrigen Dosen von QNPs oder Qu erhöhten die Zelllebensfähigkeit signifikant.(C) Die Wirkung von 72 h Vorinkubation mit QNPs oder Qu;es besteht keine signifikante Schutzwirkung gegen H2O2 (n=9, Mittelwert ± SEM).*p<0,05, **p<0,01, ***p<0,001 und ****p<0,0001.Abbildung 9 Die Schutzwirkung von Qu und QNPs gegen H2O2 in PC12-Zellen.(A) Das Diagramm der Färbung mit dem DCFDA-Kit;Inkubation mit den niedrigen Dosen von Qu oder QNPs reduzierte den durch H2O2 induzierten ROS-Spiegel.(B – D) Das Diagramm der relativen Expressionsniveaus von iNOS-, TNF-α- und Bax-Genen;Die Vorbehandlung mit den niedrigen Konzentrationen von Qu und QNPs verringerte die mRNA-Gehalte von iNOS, TNF-α und Bax, die durch H2O2 erhöht wurden (n = 3, Mittelwert ± SEM).**p<0,01, ***p<0,001 und ****p<0,0001.Abbildung 5 DPPH-Abfangwirkungen von Qu, DNPs und QNPs.(A) Das Diagramm zeigt, dass Qu im Vergleich zu QNPs und DNPs die meiste Aktivität zum Abfangen freier Radikale hatte;und seine Aktivität nahm mit zunehmender Konzentration zu, während seine Aktivität nicht von der Zeit abhing.(B) Das Diagramm der DNPs-Aktivität zeigte die niedrigsten Radikalfänger-Aktivitäten.Mit Ausnahme der Dosis von 10 µg.mL-1, die keine Wirkung hatte, zeigten DNPs eine Verbesserung ihrer Aktivitäten zusammen mit zunehmender Konzentration und Zeit.(C) Das Diagramm zeigte, dass QNPs dosis- und zeitabhängige Wirkungen zum Abfangen freier Radikale hatten (n = 3, Mittelwert ± SEM).*p<0,05, **p<0,01, ***p<0.001 und #p<0.0001.Abbildung 6 Die Toxizität von Qu, DNPs und QNPs auf PC12-Zellen.(A) Die MTT-Testergebnisse von Qu;Qu hat dosis- und zeitabhängige Toxizität auf die PC12-Zellen (ab, bc, cd, de, a'-b', b'-c', c'-d', d'-e', a''- h'', b''-c'', c''-d'', d''-e'' und e''-f'' haben signifikante Unterschiede zu *, ****, *** , *, **, ***, *, **, ***, ****, **** bzw. *).(B) die MTT-Assay-Daten von DNPs;DNPs haben eine geringe Toxizität für die Zellen (ab, a'-b', a''-b'' und b''-c'' weisen signifikante Unterschiede zu * auf).(C) die MTT-Assay-Ergebnisse von QNPs;QNPs hatten eine dosis- und zeitabhängige Zytotoxizität (ab, a'-b', a''-b'', b''-c'', c''-d'' und d''-e'' haben signifikante Unterschiede mit * und b'-c' haben signifikante Unterschiede mit **).*p<0,05, **p<0,01, ***p<0,001 bzw. ****p<0,0001.n = 6, Mittelwert ± SEM.Abbildung 7 Eingang der QNPs in die PC12-Zellen.(A) Schematisches Bild des ICP-Assays und Preußisch-Blau-Färbung.(B) das Arzneimittelfreisetzungsdiagramm;Die intrazelluläre Eisenkonzentration in PC12-Zellen war mit zunehmender QNP-Dosis erhöht (n = 3, Mittelwert ± SEM).*p<0,05 bzw. **p<0,01).(CF) Preußisch-Blau-Färbebilder;PC12-Zellen wurden mit QNP-Konzentrationen von 0 (C), 25 (D), 50 (E) und 100 µg.mL-1 (F) inkubiert.Die blau gefärbten Punkte, die an der Umgebung beobachtet werden und in die Zellen eindringen, bestätigen den Eintritt von QNPs in die Zellen.Pfeile zeigen QNPs an.Abbildung 8 Die antitoxischen Wirkungen von Qu und QNPs gegenüber H2O2 auf die Lebensfähigkeit von PC12-Zellen.(A) Die Wirkung einer 24-stündigen Vorinkubation mit QNPs oder Qu vor der H2O2-Behandlung auf die Lebensfähigkeit von PC12-Zellen;die niedrigen Dosen von QNPs oder Qu verbesserten die Lebensfähigkeit der Zellen signifikant.(B) Die Wirkung von 48 h Vorinkubation mit QNPs oder Qu;die niedrigen Dosen von QNPs oder Qu erhöhten die Zelllebensfähigkeit signifikant.(C) Die Wirkung von 72 h Vorinkubation mit QNPs oder Qu;es besteht keine signifikante Schutzwirkung gegenüber H2O2 (n=9, Mittelwert ± SEM).*p<0,05, **p<0,01, ***p<0,001 und ****p<0,0001.Abbildung 9 Die Schutzwirkung von Qu und QNPs gegen H2O2 in PC12-Zellen.(A) Das Diagramm der Färbung mit dem DCFDA-Kit;Inkubation mit den niedrigen Dosen von Qu oder QNPs reduzierte den durch H2O2 induzierten ROS-Spiegel.(B – D) Das Diagramm der relativen Expressionsniveaus von iNOS-, TNF-α- und Bax-Genen;Die Vorbehandlung mit den niedrigen Konzentrationen von Qu und QNPs verringerte die mRNA-Gehalte von iNOS, TNF-α und Bax, die durch H2O2 erhöht wurden (n = 3, Mittelwert ± SEM).**p<0,01, ***p<0,001 und ****p<0,0001.Die Radikalfängeraktivitäten von DNPs und QNPs schienen sowohl dosis- als auch zeitabhängig zu sein.(9)Die Autoren melden keine Interessenkonflikte in dieser Arbeit.Dieses Werk wird von Dove Medical Press Limited veröffentlicht und lizenziert.Die vollständigen Bedingungen dieser Lizenz sind unter https://www.dovepress.com/terms.php verfügbar und beinhalten die Creative Commons Attribution – Non Commercial (unported, v3.0) License.Durch den Zugriff auf das Werk akzeptieren Sie hiermit die Bedingungen.Nicht-kommerzielle Nutzungen des Werks sind ohne weitere Genehmigung von Dove Medical Press Limited gestattet, 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